国内外标记免疫分析技术研究现状

标记免疫分析，集体的，因为它具有许多独特的优点，已被广泛应用于基础医学和检测一大类超的技术，高特异性的临床敏感性的领域。它们具有相同的基本原理，仅由不同的标记物不同的最终测量信号的发射。虽然这种方法已在文献中报道，有超过10种，但目前已经有广泛的应用价值或包括：放射免疫法（ RIA），酶免疫测定（EIA ） ，时间分辨荧光免疫分析（ TRFIA ）和化学发光免疫分析（ CLIA ）等。下面的分析是只有四个研究现状和前景作一简要介绍。

放射免疫分析

 

首先，管固相法[ 1 ]

 

RIA开发是基于管来代替常规的固 - 液相法作为一种替代技术的电流的方向。后的固相抗原 - 抗体反应管是不完整的，低的离心分离器，但在测量管的放射性浓度可以是衍生分析物，操作简单和快速的，适于大规模的临床试验的样品。代替洗涤，离心分离，特别是减少非特异性结合，该方法提高了精度和准确性。

 

固相涂有一种抗原或抗体物理吸附法，常规的，少量的蛋白质涂层，均匀性差，仅在双位点夹心测定的。 1990级联等。 [2]马来酸酐 - 激活以共价键合到封装处理的苯乙烯共聚物聚苯乙烯管，包卷，以增加耐久性和蛋白质的均一性。然而，这个过程是复杂和难以推广。我们已经发现在实验研究中，将试管成团的双官能连接管，类似于包是共价键，以获得满意的结果。外国制造商最近开发的活化和活化的氨基酯的共价键，而不是物理吸附，从根本上解决了固相的抗体或抗原的质量，充分满足的不同的反应模式的要求。

 

体外固相放射免疫法，反应模式也相应提升，目前应用与以下几种类型。

 

一个坚实的II期反不正当竞争法：这种模式是从固相二抗管作为一种通用的技术，广泛的应用分开。测试样品和稀释液在125 I-标记的抗原的测定加入到该反第一抗体孵育固体放射性管。

 

2亲和素固相竞争法：利用亲和素包是固相试管，取第一个生物素标记抗体。当生物素标记的抗体与固体和盲试验样品测定125 I标记的抗原和培养取件，放射性洗涤后进行测定。这不仅是一种固相管普及，而且灵敏度。

 

3固相抗原竞争法[3]：检测方法是一种新的反应模式，类固醇，小分子化合物，如核苷酸和药物环。后的第一个小分子半抗原与牛血清白蛋白和涂层管，制成固相抗原，乙醇固定长期保存的。抗体与125I-标记的样品的测定加入到固相温育试管半抗原，半抗原被分析物并用125I固相竞争 - 标记的抗体结合，用放射性管。

 

4固相抗体竞争法：抗体IgG抗体包被固相物质。在测量中，将样品和125I-标记的抗原加入到固体命题孵育洗涤，放射性测量管。

 

第二，肽双抗体夹心法[4]

 

使用肽片段的抗体分子的固相双抗体夹心法管道建设，肽是一大进步的RIA技术，提高了方法的灵敏度和特异性。例如促肾上腺皮质激素合成的片段，目前16去〜 1318 〜 39片段，分别与结合片段，兔子和山羊免疫两种抗体片段。经抗体包被管的1-13片段制成固相抗体，和18-39的125 I -标记的抗体的其他片段。抗体与125I-标记的样品的测定加入到固相抗体孵育管，放射性洗涤后进行测定。该模型简单，更重要的抗原性分子是不可用的一组125I -标记的物质。

 

第三，小蛋白或抗体的应用的多肽片段

 

最近的研究结果表明，该多肽或蛋白质片段和完整多肽的小分子结合牛甲状腺球蛋白抗体片段可以是免疫应答的蛋白质或小分子和片段125 I标记，并绘制一个竞争性结合反应。这一发现应用到抗体片段的测定生物样品中构建RIA活性物质提供了理论依据。如骨钙素（BGP）是一种小分子的蛋白质的6000分子量，使用骨从动物组织中提取建立RIA外源性抗原[5]。我们将合成的分子抗体片段9-17个氨基酸的BGP （ Sigma公司） ，准备建立BGP RIA法，各项技术指标均达到国外同等水平。

 

第四，新的方法来提高分析方法的灵敏度

 

目前发现在生物材料的活性物质的一些较低水平，但重要的生物学作用，常规放射免疫测定法是难以测量的。不便推广使用冷冻干燥法，我们承认这两个间接的方法，以提高更实用的方法的灵敏度。硅烷微萃取塔（1）碳18 ：取4毫升等离子体的加0.1毫升10％的TFA，并混合10分钟，然后离心3500转/分钟，15分钟，将上清液加入到预洗微柱。然后用蒸馏水冲洗，再加入75 ％甲醇塔（含0.1％ TFA），收集了10个ml青霉素瓶3毫升浸出流出液，干燥，置于-20 ℃风扇， 0.4 mlPBS加到测量前使其溶解。在这种情况下，样品被浓缩10 - 倍。 （ 2 ）试管固相抗体捕获方法： IgG抗体稀释，取1 ml加入到试管涂层，制成固相试管。取溶液1的样品被加入到固相抗体管置37℃ 3〜5小时，将样品吸丢弃，并且内管和125I-标记的抗原，在37 ℃ 3〜5小时，洗涤后的放射性测量管。

 

酶免疫

 

环境影响评价是对发展非放射性标记免疫分析技术的基本理论的RIA 。只是一个初步的反应模式，快速定性病原微生物有限的抗原或抗体检测。简单的标记，周期长，不污染环境，并准备加快技术的环境影响评估研究和应用，方法，提高了灵敏度和应用范围已经达到了RIA的同一水平。

 

新的固相抗体技术[ 6 ]

 

1993米泽氨化应用酶标板共价结合，以取代物理吸附包被抗体，该数据包是均匀性，坚定性和控制的IgG抗体包被到一个新的水平，并建立类固醇激素的环境影响评价竞争力的量，结果令人满意。最近，美国研制成功表面琥珀酰亚胺由康宁微量滴定板中激活，并且其质量已达到的氨基酸相似的活化水平。因为该抗体以改善技术，EIA应用开发是非常快的。

 

第二，为了提高发光酶免疫测定法[7]

 

增强发光酶免疫测定（ enhaned luminescene酶联免疫吸附试验， ELEIA ）是环境影响评价技术的新发展。它具有发光信号和发射信号的时间延长，以提高稳定性和酶。发光免疫分析，同时保持较高的灵敏度，而且还克服了传统短发光酶免疫分析信号的缺点自动分析已经是在国外。

 

1 。辣根过氧化物酶（HRP ） - ELEIA ：激活一个第二抗体的ELISA板， HRP-抗原结合。一个半小时后，立即清洗和可持续光传输 - 当测量样品中，第一抗体和酶标记的抗原加入到孔中并且孵育抗添加孔发光底物（H 2 O 2溶液的苯酚和碘liminol ）信号，最小可达10-17摩尔/井检测值。

 

2 。 ALP ELEIA ：结果表明：该二氧杂环丁烷衍生物合适的缓冲液可以发射高强度的光碱性磷酸酶催化信号。根据这一特点，以创建碱性磷酸酶标记抗体的夹心EIA ，可达10〜 20摩尔/孔的最小可检测值。用发光底物为3 - （2 - 螺金刚烷）-4 - 甲氧基 - （3 - 磷含氧酸） - 苯基，2二氧杂环丁烷（ AMPPD短）溶液。

 

三，生物活性肽发光双位点夹心EIA

 

1996 1种三明治岩田内皮素（ EI - 1 ）发光酶免疫分析报告。兔抗-EI- 1抗体包被的微量滴定板的片段15 〜21 ，另一种抗ET-1的Fab'的标记的辣根过氧化物酶。鲁米诺 - 过氧化氢发光底物4 - [4 - （2 - 甲基 - 噻唑）苯酚] 。当测量样品加入到固相酶标记抗体的抗体温育，发光底物洗涤后加入。最低检出值法0.05皮克/孔。

 

四，完善新型半抗原测量灵敏度

 

以非常低的浓度的化合物的生物样品，测量在外国的作者设计一个新的模型，即多肽抗原连接，然后生物素化的抗原可以是多个生物素分子的一半。和SA- HRP作为示踪剂，建立了固相抗体竞争法。国外的一些软件包都采用了这种技术。

 

五，双特异性单克隆抗体（mAb ）双位点夹心法[ 7 ]

 

双特异性单克隆抗体是单克隆抗体的IgG分子可特异性结合抗原和酶分子。利用单克隆抗体可以在不酶解技术，操作简单，灵敏度高，特异性分析双特异性抗体被创建，是一种很有前途的方法。其缺点是，这些抗体的制备方法更复杂。仍处于实验室阶段。

 

时间分辨荧光免疫分析

 

时间分辨荧光免疫分析（时间分辨fluorimm - unoassay ， TRFIA ）排在八十年代初，另一种非放射性免疫分析，其主要功能是作为稀土元素如铕，铽或Sm3 +的标记的示踪剂。其特征在于，它有一个大的最大激发波长的斯托克斯位移337纳米，发射波长615纳米，从干涉的光发射器发射的信号光之间的290纳米的距离，一般性质的和完全排除荧光（一般荧光镧系元素离子的斯托克斯转向28纳米）的干扰。只有10多年的历史TRFIA来的，因为独特的技术优势，如灵敏度可达10-17摩尔/孔，广泛用于提高生产和衡量他们在包进步非常快，已经实现了完全自动化的分析技术。在这方面已有的理论和临床专着[ 8 ] 。的最新进展如下总结。

 

一个常见的​​Eu3 +的标记化合物：链霉亲和素 - 生物素系统已经非常完善TRFIA ，对于各种免疫反应模式。重组蛋白G 1993已经商品化。的IgG G蛋白保留的Fc端的结合特性，并且以13赖氨酸，是一种理想的材料铕标记的高比活性，不仅在一般情况下，也能进一步提高灵敏度，但它的缺点是该样品不能含有蛋白质，可以用来确定脂溶性半抗原。

 

改善的方法2的进度半抗原标记率：为了提高半抗原标记的目标的速度，以提高该方法的灵敏度的一个新的水平来测量非常低浓度的物质的生物样品中的适应。在文献中报道已经开发了两种方法，其中一种是半抗原前体的Eu -标记的多聚赖氨酸的结合，而另一个是用streptavidin标记的甲状腺素结合球蛋白作为Eu3 +的前体。两者的使用铕标记的标记前体的合成将增加1 〜 2个数量级的灵敏度的幅值的幅值。

 

化学发光免疫分析

 

1978 Schrpeder RIA和环评的基本理论，化学发光信号示踪剂，建立了基础化学发光免疫分析（ CLIA ）技术。由于其敏感性和特异性类似的关切RIA ，学者，并投入了研究方法和测量设备制造了大量的人力和财力资源，的。实验结果表明，大量的化学发光的，因为光学信号的持续时间太短，不能达到临床应用的水平。为了解决自己的方法上的缺陷，有学者研究了发光稳定性，首先由20世纪90年代初，公司Amersham公司，英国研究人员发现，加入少量的HRP催化鲁米诺化学发光反应 - 碘酚可以发射信号， 20〜 30分钟。然后生成一个套房。

 

最近的研究结果表明，甲基吖啶酯标记的抗体是一种理想的发光物质。因为如果没有催化剂，由外部因素的影响，过氧化在碱性溶液中氢仅有少量的干扰较少，可以发出强烈的光信号。此外，吖啶酯标记为一个操作简单，高稳定性，低自然背景，在不降低由标记蛋白产生的发光信号。这些因素对于提高灵敏度有利条件下，可达10-18微克/毫升的最小可检测值。

 

美国汽巴Cornig开发的ACS- 180全自动化学发光免疫分析系统，并满足吖啶酯标记免疫检测试剂盒的仪器。从一台仪器就可以完成全部测试程序。

 

雅洛和博森RIA技术建立在生物医学测试史上的一个重大突破。 RIA理论的基础上，也催生了大量的非放射性标记免疫分析技术。近年来，非放射性标记免疫分析技术的快速发展。 RIA使用放射性核素，对环境的污染，有效的短，很长一段时间来衡量自己的缺点难以实现自动化，限制了进一步的发展。目前TRFIA和CLIA自动化。 RIA是时候更换无放射性，从问题的现状。关于CLIA TRFIA和两条自动化分析系统，在推广和应用吖啶酯化学发光体系而言似乎是优势。