WT1基因在白血病中的表达及临床意义

【摘要】目的探讨WT1基因在白血病中的作用。在外周血或个别定量RT-PCR检测方法的患者骨髓单核细胞的方法WT1基因mRNA的表达。 50例白血病患者中， 41例WT1基因mRNA表达增加的结果，阳性率为82.0 ％的英寸慢性粒细胞性白血病（CML）急性髓系白血病（ AML）和急性淋巴细胞84.0 ％和93.8 ％，分别白血病的阳性率（ ALL ），并没有显著差异（P> 0.05 ） ， WT1基因阳性率为66.7 ％，其是阴性的慢性，加速和急变期阳性。 17盒15例完全缓解（ 85.2 ％ ） WT1基因阴性的患者再次复发提高WT1基因mRNA的表达。基因与白血病微小残留病检测结论WT1基因表达测量是非常重要的。
关键词；白血病基因，肾母细胞瘤的预后微小残留病
WT1基因在小儿肾母细胞瘤基因转录的调节中发现[ 1 ] 。作为肾部分肾母细胞瘤和相关的野生型WT1基因WT1的基因变异体通常归类为一种肿瘤抑制基因。然而，最近的研究表明，与野生型WT1基因的mRNA的过度表达在70％的患者的急性白血病，100％，并具有微小残留病在白血病和检测方法[ 1-3 ]具有预后意义。为了进一步探讨WT1基因在白血病中的作用，在50例我们的RT-PCR检测白血病WT1基因mRNA的表达，如下所示。
1对象和方法
1.1研究对象为门诊或住院患者，共50例。其中男31例，女19例，平均年龄38岁，根据FAB诊断，分型， 41例急性白血病患者，26例急性髓系白血病（AML） ： M13例， M2a6例如， M3B2例如， M4b1例如， M4EO1实施例中，这样的m5B6 ， M61实施例的M5a5例;在壳体16的急性淋巴细胞白血病（ALL ） （L2） 。慢性粒细胞白血病（CML ）9例，其中慢性期（ CML-CP ） 3例，加速期（ CML -AP ） 3箱子慢性粒细胞白血病（CML -BC ） 3例10例来自健康志愿者的血液样本和五例非血液病，非肿瘤性疾病的患者的骨髓样品，以35名正常对照的中值年龄的。
1.2研究方法
单核细胞的分离和1.2.1 RNA的提取取5〜10毫升的肝素化的骨髓或0.5 〜 1ml，置加磷酸盐缓冲盐水（PBS ）稀释，分离出的淋巴细胞通过Ficoll溶液（相对密度1.077 ），单核细胞， PBS将细胞是冷的，用Trizol试剂（ GIBCOBRL ） RNA切割存储-80 ℃提取RNA提取。按Trizol试剂盒说明书进行定量紫外分光光度计在260nm处的总RNA提取出来，然后。
由上海生工1.2.2 RT-PCR检测的PCR引物合成。的引物WT1基因的序列是：
上游引物：5'- GGCATCTGAGACCAGTGAGAA -3'，
下游引物：5'- GAGAGTCAGACTTGAAAGCAGT -3 ';
β - 肌动蛋白的引物序列为：
上游引物：5'- GTGGGGCGCCCCAGGCACCA -3'，
下游引物：5'- CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC -3' 。
白血病细胞系K562细胞的WT1 WT1阳性对照的对照组，无模板阴性对照的PCR产物为β - 肌动蛋白作为内标。井上参考文献[3 ]和玉米[4]的总RNA 2.0μg方法的逆转录反应中，反应体系为15μL 。 2.5μL WT1基因的cDNA拍摄和β-actin的PCR扩增体系为50μL 。 WT1基因和β - 肌动蛋白PCR条件如下：变性： 94 ℃ ， 1分钟;退火， WT1 63 ℃ ， β - 肌动蛋白60 ℃ ， 1分钟;延伸， 72 ℃， 1.5扩增30分钟WT1周期，该产品是481bp ， β -肌动蛋白， 20个循环的扩增，产物为540bp 。 cDNA的系列稀释液通过后在上述条件10-4 WT1基因的检测灵敏度的K562细胞显示RT-PCR 。 PCR扩增后，取5.0μl PCR产物进行1.3 ％琼脂糖凝胶（含为0.5μg * ml-1的溴化乙锭）凝胶电泳（ 150V ，60分钟） ，然后进行凝胶GDS 8 000图像分析仪分析（英国制造BD） 。
1.2.3数据分析，以确定K562细胞的WT1基因表达水平为1.0时， β -肌动蛋白和校正来计算相对表达水平（ WT1 mRNA表达WT1基因在患者的K562细胞在患者的RT- PCR电泳方法扫描在K562细胞的RT-PCR电泳扫描值） ，通过/ WT1基因之间的值。 Χ2试验用组间差异检验，P < 0.05为差异有显著。
2结果
在实验条件下，无表达在外周血和骨髓单个核细胞中WT1基因进行检测。 50例， 41例，可以检测到不同程度的表达， 82.0％的阳性率WT1基因的表达。中WT1基因在白血病阳性率和ALL 84.0 ％和93.8 ％ ，分别。 AML和ALL之间，其阳性率之间的AML亚型无显著差异（P> 0.05 ） 。 9案件慢性粒细胞白血病，三例CML-CP的， WT1基因mRNA的表达均为阴性， 3例CML -AP和CML -BC中3例阳性。
AML患者除M3全反式维甲酸治疗，标准DA （柔红霉素+阿糖胞苷）或HA （高中尖杉酯碱+阿糖胞苷）化疗的休息，所有患者VDCP （酰胺环磷酰胺，长春新碱，柔红霉素+泼尼松）方案化疗，其中17个完全缓解（ CR）的情况下， CR WT1基因mRNA的15例是在检测限以下（88.2％）之后。另有2例仍在检测WT1基因mRNA的表达，复发后两个月内。患者CR 4谁后复发， WT1基因mRNA的表达再次升高。无显著差异（P> 0.05 ）患者无CR之间WT1基因mRNA水平对化疗患者的缓解期。
3讨论
修改起到调节作用WT1基因定位于11p13 ， 52 〜 54KD编码转录因子，染色体上的许多转录和转录后基因。 Inoue等人[5]报道，正常人外周血细胞中，而不在骨髓细胞中WT1 mRNA的表达，在测试的WT1基因表达水平的表达，但该比例是1比白血病细胞仅1000倍更低的CD34 +细胞。他们建立了定量RT-PCR方法可以检测每104骨髓细胞和外周血单核细胞白血病细胞105的存在。