禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测方法

摘要：禽流感病毒抗原变异性强,血清亚型众多,涉及的范围也是比较广的，所以需要进一步实现保护才能够避免交叉感染，否则又会引起社会的动荡不安，对检测方法每次只能检测禽流感单个亚型,比较耗费时间精力，因此，本研究建立同时检测禽流感H5、H7、H9亚型的多重实时荧光RT-PCR技术,采用了多重实时荧光RT-PCR技术,并研制相应的快速检测试剂盒。
关键词   禽流感     H5、H7、H9   RT-PCR检测
 
引言：禽流感病毒抗原变异性强,血清亚型众多,涉及的范围也是比较广的，所以需要进一步实现保护才能够避免交叉感染，否则又会引起社会的动荡不安，对检测方法每次只能检测禽流感单个亚型,比较耗费时间精力，因此，本研究建立同时检测禽流感H5、H7、H9亚型的多重实时荧光RT-PCR技术,采用了多重实时荧光RT-PCR技术,并研制相应的快速检测试剂盒。
一、实验材料与方法
1 病毒和鸡胚 禽流感病毒H5、H7和H9亚型标准抗原,
禽流感病毒H5、H7和H9亚型分离毒株,均由深圳出入境检验检疫局实验室于2004年禽流感暴发流行期间均购自哈尔滨兽医研究所。进行了相关的分离保存操作，其他的病菌都由深圳出入境检验检疫局的实验室保存。
2 一步法RT-PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司,设备与试剂 ABI7900HT荧光定量PCR仪,核酸蛋白分析仪。病毒RNA抽提试剂盒购自Qiagen公司。
3 探针和引物的合成与设计
4 抽提禽流感病毒RNA
5 禽流感H5、H7、双重实时荧光RT-PCR的建立
6 实时荧光RT-PCR的敏感性试验
7 实时荧光RT-PCR的特异性试验
8 三重实时荧光RT-PCR的干扰性试验
9 禽流感病毒三重实时荧光RT-PCR与HA、HI
10 禽流感病毒三重实时荧光RT-PCR的田间试验
二、实验结果
2.1 三重实时荧光RT-PCR敏感性试验
在三重实时荧光RT-PCR的反应体系中,将测定的体外转录的H5亚型的RNA只加入不同稀释度的H5模板,作10倍连续稀释,试验证实三重实时荧光RT-PCR方法对H7和H9的敏感性分别约为1000拷贝和500个拷贝。
同样进行H5亚型的三重实时荧光敏感性检测,结果证实其检测的敏感性约为1000个模板拷贝。
2.2三重实时荧光RT-PCR的特异性试验
通过对多种感染鸡的病毒或细菌的检测,只加入在反应体系中,H5型特异性实时扩增图(H7和H9型特异性扩增图略)。结果证实,该方法特异性强,与其它检测对象无交叉反应。禽流感病毒一个亚型的病毒RNA作为模板,同时加入针对H5、H7、H9亚型的引物、探针进行实时荧光RT-PCR检测,结果只得到相应亚型的特异性荧光曲线,证实所设计的引物探针具有型特异性。
2.3 三重实时荧光RT-PCR的干扰性试验
将H5、H7、H9亚型不同的模板浓度进行组合,发现当两个亚型模板浓度较高而另一个亚型模板浓度较低,所建立的方法依然可以同时检测到各个亚型。三个亚型之间的其它浓度组合结果同上类似。
2.4 三重实时荧光RT-PCR对比试验
取89份经病毒鸡胚运用禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重实时荧光RT-PCR进行盲检,进行分开检测的模式进一步产生样品的研究，得出的结论就是48份为禽流感病毒H9阳性,13份禽流感病毒H5阳性,2份为禽流感病毒H5和H9混合感染,26份为阴性。经过相关的比较，能够得到结论就是两者有着明显的相似程度，几乎没有差别。
2.5三重实时荧光RT-PCR田间试验
采集的4 000多份喉腔棉拭子、泄殖腔棉拭子及临床采样的样品进行检测,阳性样品中,H9亚型的禽流感为12份,均为水禽样品;H5亚型的禽流感为5份,利用禽流感H5、H7、H9亚型三重实时荧光RT-PCR对临床结果检测到喉腔棉拭子阳性3份、泄殖腔棉拭子阳性12份、疑似病料4份。另有4份为H5和H9亚型的混合感染。检测的结果也是几乎没有任何差别的所以相关的方法需要进一步确立才能够投入使用。
三、讨论
3.1 单重与多重检测的比较
    PCR技术作为一种高度灵敏、快速简便的方法现在已经用在很多的检测上，是比较有效率的，取得了多方面的成功，能够对传统的模式形成一定的突破，使得有很多的实验都离不开这种检测的验证，有时单重PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势,还是需要更加高端的技术出台，并且进一步降低成本来实现相关的技术维持。多重PCR用于病毒、细菌、真菌的高通量快速检测和其它方面的检测已经成为热点,种微生物的检测及转基因的多种检测等。
3.2建立组合
    通过分别进行禽流感H5、H7、H9亚型单重实时荧光RT-PCR检测,确定所设计的引物和探针扩增效率高,有着比较高的灵活性能够满足筛选的需要，进一步实现相关的内容整合。
3.3三重实时荧光RT-PCR的干扰性
我们选取的各个病毒的模板量均为单重单检时效果较好的模板浓度,在建立多重实时荧光RT-PCR方法时,即3个亚型的模板浓度相对差别不大。但是如果有临床的干扰情况，那么就会出现一定的差距，进一步对现实产生了矛盾，将禽流感H5、H7、H9的模板浓度进行调整、组合,进一步讨论针对模版的浓度整合问题是否有着某种干扰。
四、小结
    必须根据仪器的检测通道进行多重实时PCR检测时,来选择荧光标记基团,才能达到避免干扰、并且实现检测的效率性质提高。
参考文献
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